Muestreador de eDNA compacto y automatizado para el monitoreo in situ de ambientes marinos

Jun 14, 2023

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 5210 (2023) Citar este artículo

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El uso de ADN ambiental (eDNA) para monitorear la biodiversidad en ambientes acuáticos se está convirtiendo en una alternativa eficiente y rentable a otros métodos como la identificación visual y acústica. Hasta hace poco, el muestreo de eDNA se lograba principalmente a través de métodos de muestreo manual; sin embargo, con los avances tecnológicos, se están desarrollando muestreadores automáticos para que el muestreo sea más fácil y accesible. Este documento describe un nuevo muestreador de eDNA capaz de autolimpiarse y capturar y conservar múltiples muestras, todo dentro de una sola unidad capaz de ser implementada por una sola persona. La primera prueba de campo de este muestreador tuvo lugar en Bedford Basin, Nueva Escocia, Canadá, junto con muestras paralelas tomadas con el método típico de recolección y filtración posterior a la recolección de botellas de Niskin. Ambos métodos pudieron capturar la misma comunidad microbiana acuática y los recuentos de secuencias de ADN representativas estuvieron bien correlacionados entre métodos con valores de R\(^{2}\) que oscilaron entre 0,71 y 0,93. Los dos métodos de recolección arrojaron las mismas 10 familias principales con una abundancia relativa casi idéntica, lo que demuestra que el muestreador pudo capturar la misma composición comunitaria de microbios comunes que Niskin. El muestreador de eDNA presentado proporciona una alternativa sólida a los métodos de muestreo manual, es compatible con las limitaciones de carga útil de los vehículos autónomos y facilitará el monitoreo persistente de sitios remotos e inaccesibles.

El aumento de la actividad humana en los ambientes acuáticos ha generado preocupaciones sobre los efectos antropogénicos que causan problemas como la hipoxia, la acidificación de los océanos y la eutrofización causada por una mayor carga de nutrientes1. Estos impactos pueden impedir el crecimiento de ciertos organismos, como las especies marinas calcificadoras, cuyas conchas y esqueletos pueden verse afectados por la acidificación2 y promover el crecimiento de otras especies, incluidas aquellas que causan la proliferación de algas nocivas (FAN) que dañan a los peces y a la economía humana3. 4. La escala de tiempo de estos cambios y sus consiguientes impactos puede variar de horas a años, y dado que cada ecosistema es único, los cambios pueden ser difíciles de rastrear, lo que requiere observaciones in situ con resolución de tiempo para evaluar los cambios adecuadamente.

Los programas de monitoreo biológico se han centrado tradicionalmente en la identificación manual de grupos taxonómicos clave de interés; sin embargo, estos programas pueden consumir mucho tiempo y requieren capacitación especial en identificación taxonómica. En los últimos años, con una disminución en el costo de la secuenciación del ADN y el tamaño cada vez mayor de las bases de datos de ácidos nucleicos, el ADN ambiental (eDNA) se utiliza cada vez más como un representante de la biodiversidad en los programas de monitoreo biológico5. El monitoreo de eDNA implica estudiar todo el ADN presente en el medio ambiente6 y es ventajoso de múltiples maneras, ya que no es invasivo y se aplica ampliamente a la microbiota y los metazoos por igual utilizando un conjunto de métodos analíticos en rápida evolución, desde la extracción de ADN sensible hasta la detección de secuencias de códigos de barras únicas7. Existen numerosos estudios que han demostrado el valor del eDNA para estudiar la diversidad microbiana, dada la importancia de su papel en la producción primaria por parte del fitoplancton y el ciclo biogeoquímico de la materia orgánica muerta. Por ejemplo, el biomonitoreo de la microbiota en entornos acuícolas ha demostrado la utilidad del eDNA para detectar la rápida respuesta microbiana a las perturbaciones ambientales y evaluar las estrategias de gestión para una industria acuícola sostenible8,9,10. Además, un número creciente de estudios ha demostrado el importante papel que el eDNA está destinado a desempeñar para el monitoreo ambiental de la biodiversidad de peces11, el seguimiento de mamíferos marinos12 y otros aspectos de la biología de la conservación13.

Los métodos actuales para el muestreo de eDNA a menudo requieren mucha mano de obra, ya que implican la recolección de muestras con botellas Niskin o equipos similares, seguidas de pasos separados de filtración y conservación, a menudo utilizando una bomba peristáltica y un congelador, respectivamente. Los componentes manuales del muestreo y análisis de eDNA limitan su uso en entornos remotos, o en entornos donde se deben tomar muestras regulares, y requieren una persona capacitada para realizar el proceso. Extender la aplicabilidad de los métodos de eDNA a problemas más desafiantes requiere automatización, incluido el desarrollo de equipos de muestreo automatizados. Los muestreadores desarrollados recientemente van desde sistemas de un solo filtro hasta sistemas de filtros múltiples más complejos, cada uno de los cuales varía en parámetros como la duración del despliegue, la clasificación de profundidad máxima y los productos químicos/conservantes utilizados. En la Tabla 1 se describe una lista representativa de los muestreadores de eDNA actuales, tanto comercialmente disponibles como prototipos de investigación.

Empezando por el más avanzado, el Environmental Sample Processor (ESP) alberga unos impresionantes 60 cartuchos de filtro; sin embargo, los muestreadores ESP se han mantenido principalmente en estudios de investigación sin realizar una transición completa a flujos de trabajo y aplicaciones comerciales, como el uso por parte de operadores de acuicultura, el despliegue en puertos urbanos, instalaciones de turbinas eólicas, etc. Este muestreador se basa en una evolución del ESP pionero, un muestreador in situ y analizador de ADN desarrollado por el Instituto de Investigación del Acuario de la Bahía de Monterey (MBARI). Estos analizadores totalmente sumergibles se desarrollaron entre 2001 y 200924 y se denominaron Generación 1 y Generación 2. Se trataba de laboratorios completos bajo el mar que realizaban la recolección de muestras y la extracción de ADN para alimentar dispositivos de microfluidos de PCR, matrices de hibridación y ensayos sándwich. Sin embargo, los instrumentos ESP Generación 1 y Generación 2 cuestan varios cientos de miles de dólares y son muy complejos de implementar y mantener, con contratos finales típicamente de millones de dólares. La última generación de instrumentación de MBARI, Generación 3, eliminó por completo el análisis integrado, con el objetivo de realizar la recolección de muestras con preservación en vehículos submarinos, seguida de análisis genómicos en laboratorio terrestre20.

Aunque el costo y la complejidad se redujeron para el ESP Generation 3, los muestreadores nuevos y optimizados tenían como objetivo mejorar aún más la escalabilidad para recolectar eDNA in situ, incluidos: el Muestreador automatizado de subsuperficie para eDNA (SASe), PolyWAG (Genómica adquirida en agua) y el CLAM. (Monitoreo Acuático Continuo de Bajo Nivel). Estos sistemas tienen un precio de miles de dólares, lo que hace que el muestreo automatizado de eDNA sea más accesible. La mayoría de estos muestreadores optimizados tienen un solo filtro, no suelen llevar reactivos de conservación o limpieza y son adecuados para implementaciones a corto plazo (por hora, por día). Si bien algunos tienen capacidad de implementación a más largo plazo (la unidad SASe tiene capacidad de conservación integrada), muchos carecen de la capacidad de autolimpieza con ácidos o lejía, y tampoco enjuagan la entrada/entrada de muestras para minimizar la bioincrustación y la contaminación cruzada. El sistema polyWAG ofrece 24 filtros con autolimpieza integrada mediante aire y autoconservación mediante etanol. La automatización adicional aumenta el costo a 3000–5000 USD. Además, estos diseños rara vez consideran factores de forma que se prestan a la integración con plataformas o restricciones de carga útil de vehículos autónomos, en algunos casos con tuberías expuestas y cables y componentes electrónicos sueltos.

(a) Representación CAD en 3D del muestreador DOT eDNA con la sección electrónica parcialmente expuesta. (b) Vista transversal del muestreador DOT eDNA, resaltando todos los compartimentos, las bolsas de almacenamiento de fluidos y el fluorómetro adjunto. (c) Muestreador DOT eDNA completamente construido desplegado bajo el agua.

Aquí presentamos un novedoso muestreador de eDNA autónomo capaz de recolectar, filtrar y preservar una muestra de agua usando un diseño innovador, todo dentro de un solo instrumento, que se muestra en la Figura 1. El muestreador puede recolectar hasta 9 muestras discretas por implementación, que, a diferencia de otros muestreadores, se almacenan en un casete extraíble que se puede cambiar fácilmente en el sitio en menos de 5 minutos. Esto permite la reubicación inmediata del instrumento, donde se puede cargar rápidamente un nuevo casete y el casete lleno se analiza en el campo o en el laboratorio. Además, la unidad se autolimpia para evitar la bioincrustación y todos los tubos están contenidos en la carcasa del instrumento para evitar que se enganchen en las líneas durante los despliegues. El muestreador también es compacto y está diseñado con asas dobles, por lo que puede ser transportado y desplegado por una sola persona. El muestreador está disponible comercialmente para su compra a través de Dartmouth Ocean Technologies Inc., Canadá. El precio de mercado inicial del muestreador de eDNA es de 55 000 USD para el instrumento y de 5000 a 10 000 USD en reactivos, opciones y casetes de filtro adicionales. Aquí describimos la prueba inicial del muestreador en un despliegue real en una embarcación pequeña. El diseño centrado en el usuario del muestreador permite la estandarización y simplificación de la recolección de eDNA, mejorando así la confiabilidad y repetibilidad del muestreo para el monitoreo ambiental. Nuestro muestreador pudo igualar los resultados obtenidos mediante el uso de los métodos típicos de captura de botella y filtración peristáltica de Niskin desde un nivel de comunidad microbiana hasta el nivel de secuencia individual.

La Universidad de Dalhousie ha colaborado con Dartmouth Ocean Technologies, Inc. (DOT) para crear una nueva muestra de eDNA que presenta un enfoque modular simple que tiene tres secciones desmontables: cartucho de filtro, sección electrónica y sección de almacenamiento de fluidos, que se muestra en la Fig. 1. El La unidad totalmente ensamblada tiene una longitud de 72,1 cm y una anchura de 16,8 cm, con un peso de 11,3 kg en el aire y 3,3 kg en agua salada. Es capaz de limpiar entre capturas de muestras, conservar las muestras capturadas y tiene 9 filtros discretos, cada uno de 25 mm de diámetro. Se pueden cargar diferentes membranas de filtro en los portafiltros (Advantec 43303010, polipropileno), lo que permite utilizar una amplia variedad de materiales de membrana y tamaños de poro en función de las especies objetivo. El cartucho de filtro del muestreador de eDNA está hecho de material de polieteretercetona (PEEK) y contiene los 9 portafiltros. Una vez que el cartucho del filtro está cargado con filtros limpios, se puede conectar a la sección electrónica del muestreador de eDNA. Este enfoque de intercambio rápido permite preparar múltiples cartuchos de filtro y luego cargarlos en el muestreador según sea necesario. El cartucho del filtro está asegurado por 3 perillas que están indexadas a la sección electrónica para evitar errores de montaje. La versión del muestreador utilizado en este documento tiene una profundidad nominal de 20 m. Sin embargo, una versión de 3000 m está disponible y ha sido probada con éxito en una cámara de presión en los laboratorios de ESL (Dartmouth, NS, Canadá).

La sección electrónica del muestreador eDNA es el núcleo del instrumento. Alberga una bomba y un árbol de válvulas personalizado, junto con una placa de circuito impreso (PCB) personalizada para la automatización y el registro de datos. La PCB y el software se describirán en la sección Arquitectura del sistema a continuación. El árbol de válvulas consta del colector de enrutamiento de fluidos, un sensor de presión, interconexiones de tuberías y válvulas de solenoide para el muestreador. El árbol de válvulas también tiene puertos que se utilizan para acoplarse fluidamente a los filtros en el cartucho del filtro y para acceder a las bolsas de fluido cargadas con reactivos y almacenadas en la sección de fluido del muestreador.

La sección de almacenamiento de fluidos del muestreador eDNA aloja y protege todos los fluidos necesarios y un fluorómetro opcional. Los fluidos almacenados en esta sección son los siguientes: ácido clorhídrico (HCl) al 5% (limpieza), RNAlater (conservación), agua purificada Milli-Q (enjuague) y residuos. Los fluidos se almacenan en contenedores Labtainer\(^{\textrm{TM}}\) BioProcess Containers (BPC) de 100 y 500 ml y se conectan a la sección electrónica con puertos de 1/4 a 28. La bolsa de desechos se usa para contener productos químicos que no se consideran seguros para descargar en el océano o en las aguas circundantes. Se usa RNAlater para conservar las muestras recolectadas, se usa HCl al 5 % para limpiar las líneas de fluido del sistema y el reflujo de la entrada de la muestra, y Milli-Q se usa para enjuagar el sistema entre los pasos del protocolo. El HCl al 5 % y el Milli-Q son efectivos para reducir la contaminación cruzada que podría tener lugar en las tuberías y los colectores del sistema entre los eventos de muestreo. HCl y RNAlater utilizados en este estudio eran de grado analítico y suministrados por Fisher Chemical (Waltham, MA, EE. UU.).

El esquema de fluidos del muestreador de eDNA se ilustra en la Fig. 2. El muestreador de eDNA presenta varias válvulas de solenoide, membranas de filtro, productos químicos integrados y acceso a los fluidos circundantes a través de los puertos de entrada y salida de muestras. El muestreador eDNA cuenta con scripts de control personalizados que se utilizan para coordinar las operaciones entre las válvulas de solenoide y la bomba de jeringa. Esta coordinación permite que el fluido se mueva de una ubicación del muestreador a otra. El movimiento del fluido se realiza simultáneamente con el control y registro de las lecturas del fluorómetro y de la presión. Los scripts personalizados se pueden programar en la memoria flash del muestreador de eDNA, o en el almacenamiento de la tarjeta SD, o se pueden ingresar manualmente a través de una terminal para un mayor control. El script que se usó para este documento se ingresó manualmente a través de la terminal para darle al usuario un mayor control y visibilidad de depuración debido a que esta era la primera vez que se implementaba el muestreador. El script personalizado contiene el protocolo de muestreo que establece lo siguiente: número de válvulas activas, volumen de recolección, límite de tiempo y caudal mínimo para cada uno de sus pasos.

Esquema de fluidos para el muestreador DOT eDNA. Se utilizan nueve filtros para la recolección programada de muestras mediante la filtración de 15 mL a 10 L o más de agua, según la carga de partículas de la muestra. Se utiliza un sensor de presión en línea para monitorear la presión transmembrana para detectar la acumulación de material en la membrana del filtro. El agua RNAlater, HCL al 5 % y Milli-Q tiene rutas de enrutamiento que se utilizan para la conservación y la limpieza.

(a) Protocolo utilizado para capturar y conservar la muestra y luego limpiar los canales de fluidos. (b) Diagrama de flujo de umbrales utilizado para cargar y ejecutar protocolos dentro de una región operativa segura especificada por el usuario (F: caudal, P: presión, T: tiempo, V: volumen). ( c ) Datos de presión capturados durante el proceso de muestreo en una membrana de filtro de policarbonato de 0,22 \(\upmu\)m. * El tiempo de muestreo depende del caudal y la turbidez del fluido especificados en el protocolo. El tiempo que se muestra arriba es para 20 ml/min en condiciones ideales.

El protocolo de muestreo utilizado para el despliegue descrito en este documento se muestra en la Fig. 3a. Debajo de cada paso, se muestra el tiempo de finalización estimado. El paso "Sample Prime" inicia el protocolo de muestreo y prepara el muestreador lavando sus canales internos con el fluido de muestra previsto. A partir de entonces, la muestra ahora está lista para realizar el paso de "Captura de muestra". Este paso empuja el fluido de muestra a través de la membrana de filtro seleccionada (M1 a M9) para la captura de muestra. Para preservar el material recolectado en el filtro, el paso "Preservación de RNAlater" empuja el RNAlater a través de la membrana del filtro seleccionado. Luego, el paso "MQ Flush" utiliza Milli-Q para eliminar el RNAlater del sistema para evitar que entre en contacto con el 5 % de HCl que se usa en el siguiente paso. El paso "Limpieza con ácido" limpia los canales fluídicos internos del muestreador de contaminantes, utilizando HCl al 5%. A continuación, el paso "MQ Flush" elimina el HCl al 5 % de los canales mediante Milli-Q. Este proceso limpia el muestreador y lo prepara para la siguiente toma de muestras. Existe la posibilidad de que quede ácido residual cerca de la entrada de muestra después de retrofluir la entrada de muestra con ácido. Sin embargo, después del retrolavado de ácido, el protocolo predeterminado también empuja 9 ml de Milli-Q a través de la entrada de muestra para enjuagar las líneas y la entrada de ácido. Esto hará que el HCl diluido al 5 % se aleje más de la entrada de la muestra y permitirá que el flujo convectivo elimine el ácido localizado antes del siguiente evento de muestreo. En esta implementación, el lavado con ácido se realizó al final de un evento de muestra y se utilizó un mínimo de 30 minutos entre muestras sucesivas. En el futuro, se podría agregar un período de espera mínimo al protocolo para aguas estancadas o de flujo bajo para evitar un falso negativo, donde HCL digerirá la muestra en el medio ambiente antes de la captura.

El algoritmo que se muestra en la Fig. 3b se ejecuta cada vez que se activa la captura de muestras. Este algoritmo ejecuta los pasos que se muestran en el protocolo de muestreo y monitorea el volumen, la presión y el tiempo para garantizar que el muestreador se mantenga en una condición de funcionamiento tolerable. El algoritmo comienza ejecutando una serie de comprobaciones. La primera verificación es determinar que la presión dentro del sistema no exceda un límite de presión preestablecido. Si la presión es superior a ese límite, el sistema reduce el caudal en un 40 % predeterminado. Después de esto, el sistema verifica el caudal, el tiempo transcurrido y el volumen desde el inicio del paso del protocolo. Si se supera alguno de los límites, la muestra pasa al siguiente paso del guión. Este procedimiento luego se repite hasta que no queden pasos en el protocolo de muestreo. Luego, el muestreador entra en un estado de bajo consumo y espera una interrupción para activar el protocolo de muestreo una vez más. La figura 3c ilustra el perfil de presión de una implementación reciente de un muestreador de eDNA en el que se realizó el protocolo de muestreo que se muestra en la figura 3a.

El muestreador es autónomo ya que puede realizar todas las funcionalidades luego de ser programado con un horario de muestreo sin necesidad de interacción humana o del usuario. Las funcionalidades incluyen captura de muestras, autolimpieza y conservación de muestras. La única interacción humana es cambiar el cartucho del filtro, los productos químicos y la batería, además de programar el programador. Más allá de la activación programada, el muestreador de eDNA contiene un procesador integrado de 32 bits que permite activarlo desde sensores externos y computadoras (por ejemplo, sistemas de asientos traseros AUV).

La arquitectura del sistema del muestreador de eDNA se muestra en la Fig. 4a. La figura 4b muestra una placa de circuito impreso completamente construida para el muestreador de eDNA. Debido a los variados requisitos eléctricos de los subcomponentes, el sistema tiene reguladores para generar múltiples voltajes que van desde 3,3 a 12 VCC, todos alimentados por una batería o entrada de fuente de alimentación de 7 a 24 VCC. El amplio rango de entrada de voltaje permite flexibilidad en las plataformas utilizadas para el despliegue (UAV/USV, boyas, amarres, etc.). El sistema se controla mediante un microcontrolador ARM Cortex M4 (STM32F411) que funciona a 84 MHz y está configurado como un sistema en tiempo real (RTS) que se rige por varias interrupciones y controles de bajo nivel para garantizar una sincronización precisa. El único microcontrolador gestiona la bomba de jeringa, el registro de datos, la comunicación y la ejecución del protocolo. La bomba de jeringa (una variante personalizada tolerante a los ácidos de la LPDA1750330H, Lee Company Ltd.) se alimenta con un circuito controlador de motor paso a paso (DRV8834, Texas Instruments) junto con un codificador de cuadratura óptica para ayudar al seguimiento preciso del volumen utilizado. Las 26 electroválvulas utilizadas por el sistema son accionadas por un circuito de pico y retención (DRV8860, Texas Instruments) que permite alimentar 32 válvulas sin carga excesiva de corriente. El DRV8860 es un dispositivo conectable en serie y permite un diseño modular para la expansión de solenoides que puede usar el sistema. El muestreador eDNA utiliza un módulo ADC de 16 bits (ADS1115, Texas Instruments) que puede leer el sensor de presión en una configuración de puente de Wheatstone con su amplificador de ganancia programable (PGA) incorporado. La señal amplificada permite leer las mediciones de presión transmembrana diferencial para garantizar que las membranas se utilicen dentro de las especificaciones del fabricante (normalmente por debajo de 4 bar, 60 psi). Se puede agregar un sensor de presión opcional para leer la presión ambiental del entorno y la profundidad del muestreador. La muestra almacena todos los datos en una tarjeta microSD interna de 32 GB con archivos y carpetas con marca de tiempo. Los usuarios interactúan con el muestreador eDNA a través de Bluetooth (a través de una aplicación de teléfono inteligente) y/o a través de RS-232 y una terminal de computadora personal. Ambos permiten enviar comandos operativos al muestreador y también son conductos para transferir datos hacia/desde el sistema; por ejemplo, establecer tiempos de muestreo programados a través del reloj en tiempo real (RTC) y/o para recuperar datos de presión y fluorómetro por membrana/muestra. En reposo, el sistema consume 1 W, mientras que el muestreo consume un pico de 10 W.

(a) Diagrama de arquitectura para el muestreador DOT eDNA que muestra las conexiones eléctricas internas y los componentes junto con las interfaces con el mundo externo, basado en el microprocesador STM32F411. (b) Vista frontal de la PCB diseñada con componentes de montaje en superficie.

El muestreador de eDNA fue alimentado por una batería para el despliegue descrito en este trabajo. El paquete de batería individual, cloruro de tionilo de litio de 561,6 Wh, duró todo el período de implementación. La batería puede soportar un máximo de 33,7 L de bombeo, suponiendo que no haya obstrucción de las membranas, lo que debería ser suficiente para 32 capturas de filtro a 1 L por captura y con un caudal medio de 10 mL/min. Los litros bombeados son la métrica más apropiada para establecer las expectativas de vida útil de la batería, ya que la bomba consume la mayor cantidad de electricidad en el muestreador eDNA (8 W, 80 % del presupuesto de energía en el pico). Estas suposiciones también dependen de la turbidez/carga de partículas del agua cuando se toman muestras. Más allá del consumo de batería o energía, los fluidos son actualmente el factor limitante para el uso continuo, ya que los depósitos de reactivos estándar son buenos para 1 cartucho de filtro (9 capturas de filtro), con planes para tener una versión de capacidad de fluido mejorada que admita 3 cartuchos de filtro (27 filtros). capturas).

Si bien no necesitábamos una fuente de alimentación externa para esta demostración, el muestreador eDNA también se puede alimentar desde un suministro típico de 7 a 24 V CC. La alimentación se proporciona a través de un cable Subconn de 6 pines y puede ser suministrada por un vehículo o plataforma. Dado el bajo consumo de energía del muestreador eDNA (pico de 10 W), el muestreador es muy adecuado para la carga del hotel disponible en la mayoría de los vehículos autónomos y también en las boyas o instalaciones que funcionan con energía solar.

Como primera prueba de cómo funciona este muestreador de eDNA in situ, el muestreador se desplegó durante un transecto del puerto de Halifax en la cuenca de Bedford, que se muestra en la Fig. 5. El muestreo se realizó a lo largo de una serie de estaciones para este transecto en la cuenca de Bedford. , donde cada estación fue muestreada una vez. En cada estación, la unidad se desplegó a 5 m de profundidad y se ejecutó la primera parte del script, donde se filtró una sola muestra de 125 ml de agua a través de un policarbonato (PC) de 25 mm de diámetro y 0,22 \(\upmu\)m membrana (Millipore). El muestreador se desplegó durante todo el tiempo que el barco estuvo en la estación (15 a 17 min), asegurando que se capturaron los 125 ml completos. Después de volver a colocar el muestreador en la cubierta, se ejecutó la segunda parte del script, donde se bombearon 6 ml de RNAlater a través de la membrana para su conservación y se realizó el paso "Limpieza con ácido". Debido a las limitaciones de tiempo del mantenimiento de la estación, se implementó este enfoque de 2 pasos; sin embargo, ambos pasos son triviales de combinar cuando el muestreador se implementa según lo previsto y sin intervención humana. Las muestras se almacenaron en RNAlater en el casete durante la noche, después de lo cual se retiraron y el prefiltro de 35 \(\upmu\)m y se almacenaron a corto plazo en un congelador de −20 \(^{\circ }\)C, luego a más largo plazo en un congelador de −80 \(^{\circ }\)C antes de extraer el ADN. Aunque el muestreador conserva las muestras con RNAlater automáticamente, los filtros se congelaron según lo recomendado para el almacenamiento a largo plazo debido a la cronología desconocida entre el transecto y la extracción de ADN. Para este despliegue, el muestreador incluía un prefiltro de 35 \(\upmu\)m en la entrada. Este filtro de entrada se agregó porque en la configuración actual, las válvulas no están clasificadas para partículas de más de 35 \(\upmu\)m. El prefiltro puede limitar el muestreador a aplicaciones que estudian microorganismos con tamaños de celda inferiores a 35 \(\upmu\)m. Actualmente estamos investigando el rendimiento del sistema con un prefiltro más grande de 100 \(\upmu\)m.

Mapa de las ubicaciones de muestreo del puerto de Halifax. Las estaciones están numeradas en orden secuencial, siendo S1 la primera y S6 la última. Se tomaron muestras en S3 y S4 en el mismo lugar con aproximadamente 2 horas de diferencia. Los diagramas de barras apiladas resaltan las 10 familias taxonómicas de bacterias relativamente abundantes en cada estación de muestreo para todas las muestras. Todos los ASV que no están dentro de las 10 familias principales se representan como "Otros". El mapa que se presenta aquí fue creado en RStudio36 usando datos GADM (Versión 3.6)48 y paquetes R ggplot239 y ggsn49.

Mapa de las ubicaciones de muestreo del puerto de Halifax. Las estaciones están numeradas en orden secuencial, siendo S1 la primera y S6 la última. Se tomaron muestras en S3 y S4 en el mismo lugar con aproximadamente 2 horas de diferencia. Se crearon gráficos de barras apiladas mediante la identificación de los 10 principales ASV de ARNr 16S de cloroplasto relativamente abundantes en cada muestra. Los ASV se identifican hasta el rango taxonómico más bajo posible, y los ASV con la misma taxonomía se distinguen además como "ASV 1" a "ASV 3". El primer ASV de la leyenda, etiquetado como "Cyanobacteria ASV 1", es el único ASV que también se recuperó del prefiltro. El mapa que se presenta aquí fue creado en RStudio36 usando datos GADM (Versión 3.6)48 y paquetes R ggplot239 y ggsn49.

Se tomaron muestras de botellas paralelas al mismo tiempo y profundidad en cada estación usando una botella Niskin de 5 L atada a una cuerda. En cada estación se desplegó el Niskin para capturar una muestra de agua directamente al lado del muestreador. Luego, esta muestra de agua se dividió en dos botellas, que se filtraron en cubierta usando una bomba peristáltica a través de membranas de PC de 47 mm de diámetro y 0,22 \(\upmu\)m (Millipore), lo que resultó en filtros duplicados de cada despliegue de Niskin. Se filtraron entre 660 y 1140 ml de agua por duplicado, luego de lo cual se registró el volumen filtrado y las membranas se congelaron inmediatamente en un criocontenedor cebado con nitrógeno líquido.

Se extrajo y procesó el ADN de todos los filtros del muestreador y un duplicado de Niskin de cada estación. Las otras muestras de Niskin se archivaron y conservaron a −80 \(^{\circ }\)C como respaldo en caso de que hubiera problemas con la extracción o la secuenciación. Se usó el mini kit de plantas DNeasy de Qiagen para extraer ADN de todas las muestras usando un protocolo modificado basado en Zorz et al.25 con las siguientes modificaciones adicionales: las muestras se incubaron a 52 \(^{\circ }\)C durante 1 hora y se Se usaron los mismos 50 \(\upmu\)l de tampón de elución de Qiagen (tampón AE) para eluir el ADN dos veces para asegurar que se extrajeran las concentraciones máximas de ADN. Después de la extracción, se enviaron 10 \(\upmu\)l de ADN de cada muestra para la secuenciación de Illumina en el Laboratorio Integrado de Recursos de Microbioma (IMR) en la Universidad de Dalhousie. El ADN se secuenció para la región V4-V5 del gen del ARN ribosómico 16S de acuerdo con el procedimiento operativo estándar de IMR para la secuenciación de amplicones como se describe en Comeau et al.26. Los fragmentos de amplicón 16S se amplificaron por duplicado mediante una sola ronda de PCR utilizando cebadores de fusión (adaptadores Illumina + índices + regiones específicas) 515F = 5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′ y 926R = 5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT-3′27,28.

Las secuencias se procesaron de acuerdo con Microbiome Helper desarrollado por IMR26 usando QIIME2 2019.729. Se utilizó Deblur (complemento QIIME2 versión 2019.7)30 para eliminar el ruido de las secuencias, así como para identificar y etiquetar variantes de secuencia de amplicón individuales (ASV)31. Los ASV son grupos de secuencias de ADN altamente relacionadas que se tratan como una sola unidad homogénea; cada uno se asigna a un grupo taxonómico particular, como especies, con múltiples ASV potencialmente mapeados en el mismo grupo. Después de la identificación, los ASV se clasificaron utilizando la base de datos SILVA 13232,33, así como la base de datos PhytoREF34 para una clasificación adicional de las secuencias de cloroplastos. Se crearon dos tablas de ASV a partir de estos datos: una con los recuentos de ASV sin procesar y una segunda donde los recuentos de ASV sin procesar se enrarecieron a 4000 para poder comparar la abundancia relativa entre las muestras. La rarefacción es un proceso de normalización a través del cual muestras de diferentes tamaños se submuestrean hasta un umbral normalizado35. Las curvas de rarefacción en la Fig. S2 se pueden encontrar en la información de apoyo. Todos los gráficos se realizaron con RStudio36 utilizando los siguientes paquetes: UpSetR37, Phyloseq38, ggplot239 y ggpmisc40.

En total, se tomaron muestras de 6 estaciones en la primera implementación de campo del muestreador eDNA; las coordenadas y el momento en que se tomaron las muestras se pueden encontrar en la Tabla S1. El mapa de estaciones muestreadas se muestra en la Fig. 5. En 2 de las 6 estaciones, S2 y S6, no se alcanzó el volumen objetivo predeterminado. Esto se debió a que la presión transmembrana alcanzó el umbral, con suficiente material acumulado para bloquear la membrana del filtro, por lo tanto, el umbral de tiempo de permanencia en la estación se alcanzó antes que el umbral de volumen. Las estaciones restantes, S1, S3, S4 y S5 capturaron el 100 % de la muestra, como se muestra en la Tabla 2. La Tabla 2 describe varias métricas con respecto al ADN extraído y los datos de secuenciación sin procesar para cada muestra de transecto y el prefiltro. Aunque las concentraciones de ADN eluido fueron más bajas en las muestras recolectadas con el muestreador, al considerar la diferencia en el volumen filtrado, la concentración de ADN de la fuente original (es decir, agua marina) es comparable entre Niskin y el muestreador, pero no idéntica, ya que las extracciones de ADN no son 100 % eficientes. . Además, el prefiltro tenía una concentración de ADN eluida más baja y casi 0 ng/mL en la muestra original.

La Figura 5 muestra las 10 familias con la abundancia relativa más alta en cada estación para ambos métodos de recolección, también se muestran una al lado de la otra en la Figura S1. Los dos métodos de recolección arrojaron las mismas familias principales en una abundancia relativa casi idéntica, lo que demuestra que el muestreador pudo capturar la misma composición comunitaria de microbios comunes que Niskin. Las 10 familias más abundantes se encontraron en las 12 muestras, con Rhodobacteraceae teniendo la mayor diferencia en abundancia relativa entre Niskin y sampler en 5 de 6 estaciones (9% en S1, 5% en S3–S6) y Flavobacteraceae teniendo la mayor diferencia en S2 (6%). La diferencia entre todos los demás taxones en cada estación fue inferior al 5% con la excepción de Burkholderiaceae. La familia Burkholderiaceae mostró alta varianza en el sitio S1 (muestreador: 10%, Niskin: 2%) y en menor medida S2 (muestreador: 4%, Niskin: 2%). Esto se debió a un ASV en particular clasificado como Ralstonia picketti, que se encontró en todas las muestras del muestreador, pero en ninguna de las muestras de Niskin. Un análisis similar de la comunidad de fitoplancton en la Fig. 6 muestra una fuerte floración de Thalassiosirales que se presentó como un ASV de cloroplasto único que domina ambos tipos de muestras (Niskin y muestreador) en todas las estaciones, que van desde el 30 % de todas las lecturas de cloroplastos en S4 Niskin hasta el 60 %. % en S3 Niskin. No se encontró evidencia de Thalassiosirales en la muestra del prefiltro y el único ASV encontrado en el prefiltro (representado como cianobacteria en la Fig. 6) se encontró en baja abundancia relativa en el resto de las muestras.

Diagramas de dispersión que muestran recuentos sin procesar de todos los ASV en muestras de cada método de recolección representados entre sí. El único punto rojo indica los recuentos sin procesar de Ralstonia picketti, un contaminante potencial que se encuentra solo en el muestreador. El contaminante disminuye con una mayor utilización del muestreador, de S1 a S6, lo que indica que las nuevas construcciones de muestreadores deben limpiarse a fondo después del ensamblaje para eliminar los contaminantes.

Los resultados de las muestras de Niskin y eDNA también fueron cuantitativamente similares a nivel de ASV individuales. La Figura 7 muestra la correlación entre los ASV del muestreador y los ASV de Niskin (tanto bacterianos como de fitoplancton) en cada sitio. Los valores de R\(^{2}\) oscilaron entre 0,71 y 0,93, y las estaciones posteriores tuvieron valores de R\(^{2}\) más altos que las estaciones S1 y S2. La Ralstonia picketti ASV mencionada anteriormente está resaltada en rojo y tiene recuentos más altos en S1 y S2 (7,5 % y 2 % del recuento total respectivamente), con menor abundancia en las estaciones S3–S6 (\(\le\) 1 % del total cuenta). La figura S3 muestra un diagrama de dispersión de los recuentos combinados de cada ASV en las estaciones 1 a 6 para cada método.

Gráfico alterado de ASV en cada muestra, así como el prefiltro (PF). Cada columna muestra el recuento de ASV con el patrón de ocurrencia indicado por los puntos negros con las muestras asociadas. El número total de ASV asociados con cada muestra se muestra a la izquierda. Aquí se muestran conjuntos de muestras con 3 o más ASV asociados, y no se muestran las combinaciones de muestras que devuelven ASV que ocurren solo una o dos veces.

Por último, examinamos los patrones de presencia y ausencia de cada ASV en las 13 muestras del muestreador, Niskin y prefiltro. El patrón de presencia/ausencia más común incluyó 190 ASV que se encontraron solo en la muestra de prefiltro (Fig. 8); sin embargo, estos representan menos del 10 % (20 936 de 235 501 secuencias recolectadas de todas las muestras). Por el contrario, solo se encontraron 65 ASV en el prefiltro y al menos otra muestra. Esto refuerza aún más que el prefiltro no filtró ningún ASV importante en la columna de agua y, en cambio, tenía su propia composición. Se encontró un total de 124 ASV en los doce sitios de muestreo de Bedford Basin, 24 de los cuales también se recuperaron del prefiltro. De estos, los 100 ASV recuperados solo de los sitios de Bedford Basin representaron 171 345 secuencias (72,8 %), mientras que los 24 ASV recuperados de todas las muestras representaron 23 341 secuencias (10,0 % de todas las secuencias recuperadas). Ningún otro patrón de presencia/ausencia fue exhibido por más de siete ASV, y la mayoría de los patrones se observaron una o dos veces en el grupo de ASV. Estos resultados demuestran aún más la homogeneidad de las muestras en todas las estaciones y la consistencia entre el muestreador y los conjuntos de datos de Niskin. Se asignaron un total de 4308 secuencias al probable contaminante Ralstonia pickettii en todas las muestras de eDNA; estos disminuyeron en el recuento de 4308 en la muestra S1 a 80 en la muestra final S6.

Los resultados presentados en este documento detallan la prueba y el despliegue exitosos de un nuevo muestreador de eDNA. En comparación con las muestras simultáneas de botellas de Niskin, el muestreador capturó una comunidad casi idéntica de bacterias y fitoplancton en todas las estaciones. Esto es a pesar de las diferencias en el protocolo, como el volumen filtrado y la resolución temporal, alineándose con estudios previos, que han mostrado resultados similares42,43. Un estudio reciente realizado con 3G ESP también demostró que los resultados eran equivalentes entre el muestreo autónomo y el manual44. Curiosamente, los volúmenes de muestra en el estudio ESP se invirtieron donde el muestreador autónomo filtró un volumen más alto (1 L) y el muestreo manual filtró un volumen más bajo (36–100 mL)44. Nuestro protocolo generó resultados comparables con un volumen de muestreo autónomo más bajo, lo que permite reducir al mínimo el tiempo de muestreo.

Otra diferencia entre el muestreador y los métodos Niskin es el prefiltro de 35 \(\upmu\)m instalado en la entrada del muestreador debido a las limitaciones de partículas en la bomba y las válvulas. Sin embargo, los resultados aquí muestran que el prefiltro no afectó los resultados ya que el muestreador todavía recogió la comunidad en la columna de agua. Mantener el prefiltro es ventajoso porque permite que el muestreador permanezca en un tamaño pequeño y portátil, lo que permite un despliegue más fácil en el campo, particularmente en embarcaciones pequeñas con poco espacio en la cubierta. El prefiltro tampoco afectó los resultados debido a la obstrucción, debido al protocolo de limpieza y los lavados previos a la muestra que incluyen un retrolavado a través de la entrada, lo que empuja el material fuera del prefiltro.

La única discrepancia notable entre las muestras fue que se encontró un ASV clasificado como Ralstonia picketti en todos los resultados de las muestras, pero en ninguno de los resultados de Niskin. Esta bacteria se encuentra comúnmente en el medio ambiente y es capaz de crecer en plásticos45, lo que significa que probablemente fue una forma de contaminación en la muestra de pruebas anteriores. A pesar de la prevalencia de esta bacteria, los recuentos sin procesar y la abundancia relativa disminuyeron rápidamente en el muestreo posterior, lo que indica que el protocolo de limpieza eliminaba la bacteria de las líneas con cada muestra. Por lo tanto, con la optimización, el protocolo de limpieza puede prevenir la contaminación en el futuro.

En este trabajo no se utilizaron controles negativos. Esto se debe a que las capturas de las botellas de Niskin actúan como mecanismo de control o comparación. Sin embargo, el sistema se puede configurar de tal manera que utilice las reservas integradas de Milli-Q como mecanismo de control negativo. Suponiendo que el volumen de reactivos no sea una limitación, un modo de operación podría ser tener un blanco Milli-Q entre cada muestra, o 5 muestras y 4 blancos. El inconveniente de esto son los volúmenes potencialmente grandes de Milli-Q (control en blanco/negativo) que tendrían que implementarse y reemplazarse después de cada implementación.

En este estudio, se tomaron muestras de cada sitio una vez con el muestreador eDNA y la captura de Niskin Bottle. Sin embargo, publicaciones anteriores demuestran que la composición bacteriana puede cambiar en una escala de tiempo semanal en Bedford Basin46. Ahora que se ha demostrado que la configuración inicial del muestreador de eDNA se puede implementar con éxito, los estudios de series temporales en una variedad de entornos acuáticos permitirían conocer los cambios microbianos con una participación humana mínima. Más allá de los estudios de series temporales, también se puede implementar múltiples muestreadores en réplica para evaluar la repetibilidad entre instrumentos. Ambos tipos de estudios están planificados actualmente para 2023-2024 y verán 6 muestreadores desplegados durante varios meses.

Los estudios futuros también podrían usarse para observar el eRNA, con el fin de aprovechar la ventaja de que el muestreador conserva los ácidos nucleicos inmediatamente después del muestreo. Aunque observamos un rendimiento excelente con RNAlater, sería beneficioso probar diferentes productos químicos para la conservación, ya que hay muchos laboratorios que utilizan otras soluciones como el tampón de Longmire47 y DNAgard\(\circledR\)16 para conservar sus muestras.

En conclusión, estos resultados demuestran la prueba y el despliegue exitosos de un muestreador de eDNA autónomo y novedoso capaz de limpiar y conservar, e incluye un cartucho intercambiable en el campo. Estos aspectos son beneficiosos para la investigación y el monitoreo, particularmente en lugares remotos y durante largos períodos de tiempo en áreas como las Áreas Marinas Protegidas (AMP). Los estudios futuros del sistema incluirán la optimización de la limpieza, así como la integración del fluorómetro y las pruebas colaborativas del sistema en múltiples escenarios de implementación. En general, este muestreador de eDNA ampliará el uso de eDNA en los programas de monitoreo, haciéndolo más accesible y conveniente que los métodos de muestreo tradicionales.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles en el repositorio del Centro Nacional de Información Biotecnológica, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA917080.

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Descargar referencias

Se expresa gratitud hacia el Ocean Supercluster de Canadá (Proyecto OceanAware), el Programa de Asistencia para la Investigación Industrial del Consejo Nacional de Investigación de Canadá (NRC IRAP), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) del Programa de Becas de Descubrimiento de Canadá, el Programa de Becas Postdoctorales Industriales Mitacs, el Canada First Research Excellence Fund (CFREF) a través del Ocean Frontier Institute (OFI) y la Canada Foundation for Innovation (CFI). Agradecemos a la Dra. Jennifer Tolman por ayudar con el análisis de ADN ya la Prof. Ruth Musgrave por permitirnos unirnos a su transecto portuario. Agradecemos a Lee Miller y Mark Wright por sus contribuciones en el diseño del chasis del muestreador eDNA y la representación de sus imágenes para su uso en este documento.

Estos autores contribuyeron por igual: Andre Hendricks y Connor M. Mackie

Departamento de Ingeniería Eléctrica e Informática, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

André Hendricks, Colin Sonnichsen y Vincent Sieben

Dartmouth Ocean Technologies Inc, Dartmouth, NS, Canadá

Connor M. Mackie, Edward Luy, Colin Sonnichsen, James Smith, Iain Grundke, Arnold Furlong, Robert G. Beiko, Julie LaRoche y Vincent Sieben

Departamento de Farmacología, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

mahtab tavasoli

Facultad de Ciencias de la Computación, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

Roberto G. Beiko

Departamento de Biología, Universidad de Dalhousie, Halifax, NS, Canadá

julie laroche

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Todos los autores contribuyeron a los aspectos del diseño, fabricación y prueba del instrumento. AH, EL y CS crearon el diseño inicial, AH y CM realizaron la mayor parte del trabajo experimental, CM realizó el trabajo de campo asistido por JS e IGIG hizo la ingeniería mecánica; AH y JS hicieron la ingeniería eléctrica. RB, CM y JLR realizaron análisis de datos genómicos. MT, RB, AF, JLR y VS obtuvieron fondos y supervisaron el proyecto. Todos los autores escribieron, revisaron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Vincent Sieben.

Arnold Furlong, Julie LaRoche, Mahtab Tavasoli, Robert Beiko y Vincent Sieben declaran participación accionaria en DOT Inc. Connor Mackie, Edward Luy, Colin Sonnichsen, James Smith e Iain Grundke son empleados de DOT Inc. Andre Hendricks no tiene intereses financieros en DOT Cª

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Reimpresiones y permisos

Hendricks, A., Mackie, CM, Luy, E. et al. Muestreador de eDNA compacto y automatizado para el monitoreo in situ de ambientes marinos. Informe científico 13, 5210 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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Recibido: 19 diciembre 2022

Aceptado: 25 de marzo de 2023

Publicado: 30 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32310-3

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